UCSC复现文章circRNA--引物/敲低/功能及修饰预测

本期GBhouse将对已发表文献circRNA详细信息进行复现，现在提几个问题：1.如何根据circRNA高通量测序在UCSC查找circRNA序列？2.circRNA成环如何验证？3.circRNA敲低引物如何设计？4.UCSC怎么预测circRNA功能位点（如IRES，miRNA结合）？

（复现文献信息）

1 收集文章中的circRNA信息

1.1 研究基因及对应基因组位置

通过全文，可知作者通过circRNA高通量测序筛选到可能在肝癌细胞中存在重要调控的circRNA（SCD-circRNA2）。复现文中主要研究的SCD-circRNA2，染色体位置信息：chr10：102122370-102122756。

（图1.1 本文重点研究的circRNA基因信息）

1.2 SCD-circRNA2成环信息

为了生成适合SCD-circRNA2过表达的载体，扩增了SCD-circRNA 2的基因组区域，其反向剪接位点位于50 bp、200 bp或500 bp序列两侧。

（图1.2 扩增SCD-circRNA2策略示意图）

此外，文中交代了SCD-circRNA2成环信息，即来源于母基因SCD外显子6的部分序列。

（图1.3 SCD-circRNA2来源示意图）

通过以上信息，小结：1. 本文研究目标SCD-circRNA2；2. 染色体位置：chr10：102122370-102122756，3. 扩增策略是反向剪接两侧的50-200-500bp。

2 使用UCSC查询和获取SCD-circRNA2基因序列

使用UCSC网站（https://genome.ucsc.edu/）查询和获取SCD-circRNA2基因序列，进行具体操作如下：

2.1 UCSC数据选择

将使用Human GRCh37/hg19 SCD-circRNA2基因信息及获取，一般情况下，均使用Human GRCh37/hg19（常用），而对于一些未知的基因信息可能需要尝试Human GRCh38/hg38。

（图2.1 Human GRCh37/hg19查询序列信息）

2.2 查找确定SCD-circRNA2基因信息

根据文中信息，知道SCD-circRNA2在染色体位置：chr10:102122370-102122756，可见该位置信息粘贴到USCS查询对话框中进行查询，操作如下：

（图2.2 查询SCD-circRNA2基因序列操作示意图）

右击SCD即可见“get DNA for SCD”，点击该条目即可，如图2.3所示：

（图2.3 如何获取SCD基因序列示意图）

在接下来的操作界面，根据图2.4标记操作。首先是将SCD基因在染色体的位置更换为SCD-circRNA2所在位置（即前文交代的位置：chr10:102122370-102122756）；其次是选择“all upper case”一般是正向（+）的意思，当然也有少部分是方向/负向（—）；最后是点击“get DNA”即可获得SCD-circRNA2（chr10:102122370-102122756）碱基序列。

（图2.4 获取SCD-circRNA2 chr10:102122370-102122756碱基序列操作示意图）

>hg19_dna range=chr10:102122370-102122756（获取SCD-circRNA2碱基序列，可编辑）

TCCCTCCTGCACACAGAATGCTCAGGGTCACTGAACCACTGCTTCTCTTTTGAAAGTAGAGCTAGCTGCCACTTTCACGTGGCCTCCGCAGTGTCTCCACCTACACCCCTGTGCTCCCCTGCCACACTGATGGCTCAAGACAAGGCTGGCAAACCCTCCCAGAAACATCTCTGGCCCAGAAAGCCTCTCTCTCCCTCCCTCTCTCATGAGGCACAGCCAAGCCAAGCGCTCATGTTGAGCCAGTGGGCCAGCCACAGAGCAAAAGAGGGTTTATTTTCAGTCCCCTCTCTCTGGGTCAGAACCAGAGGGCATGCTGAATGCCCCCTGCTTACTTGGTGAGGGTGCCCCGCCTGAGTCAGTGCTCTCAGCTGGCAGTGCAATGCTTG（默认5’→3’）

3 如何实现circRNA反向组装

3.1 circRNA反向组装

一般情况是将3’端（剪接受体）截取100-200bp置于5’端（间接配体）（具体根据circRNA长度），这样重新组装的circRNA用于引物（primer）设计，剪接位置即为剪接位点（成环）。

（图3.1 circRNA引物设计示意图）

（图3.2 文中提供的SCD-circRNA2，红色为推文中将反向因为进行翻转）

SCD-circRNA2设计，将颠换3’端188bp粘贴至SCD-circRNA2的5’端（蓝色碱基）这样就形成了一个反向剪接（back-splice sequence）。

3.2 查找文中因为

根据文中提到的上游引物（GCTGCTTACTTGGTGAGGGTG）和下游引物（AGATGTTTCTGGGAGGGTTTG→CAAACCCTCCCAGAAACATCT（颠换方向）），查询引物对应的位置，引物设计的目的是为了验证是否能够成环。

4 获取的SCD-circRNA2序列准确性验证

使用UCSC“Tools-balt”;

（图4.1 UCSC序列比对/blast操作示意图）

将获取的SCD-circRNA2序列粘贴至比对对话框，注意UCSC识别fasta格式，需要在基因序列前边添加“>gene symbol”，然后点击Submit；

（图4.2 UCSC序列比对/blast操作设置示意图）

通过UCSC网站blast，发现获取的SCD-circRNA2序列与数据库能够达到百分百重合（图4.3）；

（图4.3 UCSC序列比对/blast结果示意图）

5 UCSC潜在功能及修饰预测

在UCSC完整还提供了预测circRNA的IRES，充当海绵吸附miRNA和m6A修饰（https://genome.ucsc.edu/s/atcgene/circbank_m6A_track）。只需要将circRNA所在基因组的位置信息（如SCD-circRNA2 chr10:102122370-102122756）粘贴进去即可查询。

（图5.1 circRNA基本功能及修饰位点预测结果展示）

6 circRNA沉默/敲减位点的选择

首先根据文中提到的siRNA序列（短干扰RNA或沉默RNA，是一类双链RNA分子，长度为20-25个碱基对，类似于miRNA，并且在RNA干扰（RNAi）途径内操作）（siRNA1: (F)CAGUGCAAUGCUUGUCCCUTT/(R)AGGGACAAGCAUUGCACUGTT;siRNA2:(F) CAAUGCUUGUCCCUCCUGCTT/(R) GCAGGAGGGACAAGCAUUGTT）。可见circRNA的siRNA针对的是circRNA的剪接位点。

本期讲解结束，主要内容回顾：1. 根据circRNA基因组location查询序列；2. circRNA设计引物验证成环情况；3. circRNA如何利用UCSC预测miRNA结合，IRES和m6A。